睡眠剥夺差异表达基因的筛选及生物信息学分析
欧阳靖良
【摘要】：人的一生有三分之一的时间都处在睡眠状态下,睡眠和每一个人的生理及心理状况密切相关,它是中枢神经系统精细调节下的一种生理过程。近一个世纪以来,它引起了很多学者的极大兴趣,并致力于这一领域的相关研究。虽然睡眠的生理功能和机制仍不十分清楚,但睡眠的重要作用早已成为大家的共识。人可以绝食自尽,却不能做到长期拒绝睡眠。睡眠剥夺或者睡眠不足是一种常见的社会现象,它给人们带来的负面影响正受到越来越多的关注。睡眠量不正常以及睡眠中出现异常行为,通常表明睡眠和觉醒正常节律性交替出现了紊乱。睡眠障碍可由多种因素引起,常与躯体疾病有关,包括睡眠失调和异态睡眠。睡眠与人的健康息息相关。调查显示,很多人都患有睡眠方面的障碍或者和睡眠相关的疾病,成年人出现睡眠障碍的比例高达30%。另外,据中国6城市的调研显示,成年人一年内的失眠患病率高达57%。专家指出睡眠是维持人体生命极其重要的生理功能,对人体必不可少。长期失眠会导致大脑功能紊乱,对身体造成多种危害,严重影响身心健康。目前国内外大量的研究发现,睡眠剥夺可以影响某些基因的表达,抑制炎症反应相关因子的形成,还有可能引发糖尿病,减少睡眠也有增加抑郁症的患病风险。几十年来,虽然人们对睡眠剥夺给人体造成的不良影响有了进一步的了解,但其作用机制仍不清楚。为了更好地预防和治疗睡眠剥夺相关疾病,需要从分子水平揭示其发病机制。随着人类基因组计划的逐步实施以及分子生物学相关学科的快速发展,越来越多的动植物、微生物基因组序列得以测定,基因序列数据正在以前所未有的速度迅速增长。然而,如何去研究如此众多基因在生命过程中所担负的功能就成了全世界生命科学工作者共同的课题。为此,建立新型杂交和测序方法以对大量的遗传信息进行高效、快速的检测、分析就显得格外重要了。基因芯片(又称DNA芯片、生物芯片)技术就是顺应这一科学发展要求的产物,它的出现为解决此类问题指引了方向,并且提供了光辉的前景。由于基因芯片技术能够将大量探针同时固定于支持物上,因此可以对样品大量序列进行一次性的检测和分析。正因为各种技术的发展和革新,解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、操作序列数量少、自动化程度低、检测效率低等不足的特点。而且,通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值,如基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等。RNA水平处在不同环境压力、时间、空间等方面下,表达有显著性差异的基因通常称为差异基因。人体基因组图谱好比是一张能说明构成每个人体细胞脱氧核糖核酸(DNA)的30亿个碱基对精确排列的“地图”。科学家们认为,通过对每一个基因在疾病中差异表达的测定,人们将能够找到新的方法来治疗和预防许多疾病,如癌症和心脏病等。大多数基因芯片的基因表达谱实验的目的是为了识别出在不同条件下受到调控的基因,这需要对各种的条件进行比较以确定不同条件下的基因表达是否存在差异,即基因表达的差异或者改变可能是有条件或表型上的改变所导致。这类实验的主要目的是为了是识别在不同条件下差异表达的基因。蛋白质是生命功能的执行者,也是生命现象的直接体现者。为了解释生命在生理或病理条件下的分子机制,必需对蛋白质结构和功能进行研究。而蛋白质功能的实现往往表现为蛋白质与蛋白质或蛋白质与其他生物大分子之间的相互作用。细胞结构、生化活性和能动行为是蛋白质的相互作用的基础。蛋白质间的相互作用是其功能的直接体现,细胞进行生命活动过程是蛋白质在一定时间和空间下的相互作用的生理结果。建立模式生物系统中所有蛋白质相互作用的网络,即蛋白质相互作用组。为了研究蛋白质的其它功能和系细胞的全局特征,因此,构建蛋白质相互作用网络的研究显得尤为重要。一般情况下,蛋白质相互作用网络的破坏和崩溃,可能引发细胞功能障碍,严重时可能导致细胞的死亡。因此,可以通过建立蛋白质相互作用网络,研究蛋白质作用网络的动态模型。这将有助于寻找合适的药物作用靶点,为新药的开发提供坚实的理论基础。近年来用于蛋白质间相互作用研究的先进分析技术包括：酵母双杂交系统、荧光共振能量转移技术、表面等离子体共振技术、蛋白质芯片技术。但近几十年来,随着生物信息学的快速发展,越来越多的科研工作者开始运用生物信息学的方法来研究蛋白质的相互作用。经过十几年的快速发展,生物信息学已经步入了后基因组时代。生物信息学的研究内容已经不再局限于对基因组和蛋白质组数据的高效分析,而是转移到比较基因组学、代谢网络分析、基因表达谱网络分析、蛋白质结构与功能分析以及药物靶点筛选等方面的研究。目前,生物信息学已经分别与功能基因组、蛋白质组、结构基因组等研究领域互相配合、紧密相关,是目前的系统生物学研究的研究热点。生物学家在揭示一些具有一般规律的生命现象时,通常会选择某种生物物种作为模式生物,包括它们的生长特性、一些基因的序列和功能等。模式生物能够成为科学研究当中不可替代的实验方案,是由于地球上各种生物许多的基本生命活动通常都是保守的。根据研究者想要解决什么样的科学问题,才能确定我们选择什么样的生物作为模式生物,然后再选择一些适合这种模式生物的实验方案。几十年的研究和发展,人们就发现,发育现象的难题往往可以通常相对简单生物的研究得到解决。因为这些相对简单的生物往往很容易被观察和进行相关的实验操作。因此,模式生物的研究策略不但可以应用于遗传学的研究,也可以广泛的应用于发育生物学的科学研究。经过几十年的科学研究的经验累积,已经总结出了一些典型的模式生物,包括线虫、果蝇、非洲爪蟾、蝾螈、小鼠等。随着人类基因组计划的完成和后基因组研究时代的到来,模式生物研究策略得到了更多的重视。基因的结构和功能可以在其它合适的生物中去研究,同样人类的生理和病理过程也可以选择合适的生物来模拟。在分类学上,小鼠属于哺乳纲、啮齿目、鼠科、小鼠属动物。小鼠是通过小家鼠驯化而来的。它主要分布于世界各地,通常被选择为理想的实验动物。由于受到人工的长期饲养和选择培育,现各大实验室及生物技术公司已育成1000多近交系和独立的远交群。小鼠早在17世纪就被选择为研究对象进行实验,现已成为使用量最大、研究最详尽的哺乳类实验动物之一。在20世纪生命科学发展的历史长河中,果蝇扮演了极其重要的角色。果蝇作为一种模型生物,一直都表现的非常活跃,尤其是在遗传学的研究和发育的基因调控研究方面。另外,各类神经疾病的研究、老年痴呆症、帕金森病、酒精中毒和药物成瘾等也经常使用果蝇作为研究对象,进而模拟和推测人体的生物学规律。衰老与长寿、学习记忆与某些认知行为的研究等也逐渐开始尝试用果蝇为模式生物来展开相关的科学研究。本研究主要内容分为以下两个部分：第一部分：睡眠剥夺对小鼠海马体基因表达的影响及生物信息学分析本研究首先利用Qlucore Omics Explorer 3.0软件对基因芯片数据GSE33302差异表达基因进行分析与筛选。Peixoto L等提交的GSE33302芯片数据,采用的是商业化的离子通道芯片平台GPL1261,其中9个样本来自睡眠剥夺小鼠海马体,对照组数据来自8个非睡眠剥夺小鼠海马体。对GSE33302的数据分析筛选出了101个差异表达基因,其中下调基因66个,上调调基因35个。运用PANTHER和DAVID两种生物学信息学工具对差异表达基因进行综合分析发现,在生物学途径中,睡眠剥夺差异基因主要涉及促性腺激素-释放激素受体通路、肾上腺素和去肾上腺素生物合成通路、趋化因子和细胞因子介导的信号通路、细胞凋亡信号通路、亨廷顿舞蹈病通路和帕金森病通路等生物学通路；在生物学过程中,差异基因主要涉的生物学过程包括及代谢过程、生物调节过程、发育过程、细胞定位过程、免疫系统过程和细胞凋亡过程等过程。最后,利用蛋白质相互作用网络分析软件STRING对数据集GSE33302中筛选到的差异基因进行了蛋白质相互作用网络的构建。通过对蛋白质相互作用网络图进行分析和计算,在数据集GSE33302筛选到的101个差异基因中,Usp2、Armt1、Dbp、Per1、Per2、Cry1、Cry2、Clock、Mapk1、Prkag1、Prkag2、Prkag3、 Prkaa1、Prkaa2、Prkab2、Eprs、Rars、Xpo1、Upf3b、Notch1、Rae1、Apoe、 Apob、Apoa1、Lipc、Hspa5、Sin3a、Hdac1、Jun蛋白与其它≥5个蛋白存在相互作用关系,为此蛋白相互作用网络的中心节点。删除这些节点蛋白后,网络结构涣散。因此,这些蛋白在睡眠剥夺相关疾病的发生和发展中可能起着至关重要的作用。第二部分：睡眠剥夺对果蝇大脑基因表达的影响及生物信息学分析本研究首先利用Qlucore Omics Explorer 3.0软件对基因芯片数据GSE4174进行了差异表达基因的分析。Zimmerman等提交的GSE4174芯片数据,采用的是商业化的离子通道芯片平台GPL72。选择其中9个样本来自睡眠剥夺果蝇大脑组织,对照组数据来自6个非睡眠剥夺果蝇大脑组织进行分析。对GSE4174的数据分析筛选出了171个差异表达基因,其中下调基因125个,上调基因46个。通过Panther生物学通路分析发现,差异表达基因共涉及20个生物学通路,其中主要涉及硫胺素代谢途径、Notch信号途径、转录调节途径、多巴胺受体调节信号途径、Wnt信号途径、Ras途径、丙酮酸代谢途径、嘌呤从头合成途径和DNA复制途径等。Panther生物学过程分析表明,差异基因主要涉及细胞组成的生物合成过程、细胞过程、细胞定位过程、细胞凋亡过程、生物调节过程、对刺激物的反应过程、发育过程、多细胞组织过程、生物链接过程、代谢过程和免疫系统过程等。Panther分子功能分析表明,差异表达的基因主要涉及转运体活性、蛋白结合转录因子活性、酶调节活性、催化活性、受体活性、核酸结合转录因子活性、抗氧化活性结构分子活性和结合活性等。Panther细胞组成分析表明,差异表达基因主要包括细胞膜、细胞器和高分子复合物等细胞成分。最后,利用蛋白质相互作用网络分析软件STRING对数据集GSE4174中筛选到的差异基因进行了蛋白质相互作用网络的构建。通过对蛋白质相互作用网络图进行分析和计算,在数据集GSE4174筛选到的171个差异基因中,brm、DDB1、Ssl1、His3.3A、Spt5、Cyck、Hsp83、CG1646、CG6015、CG8258、CG5525、 CG1416和CGtgamma蛋白与其它≥5个蛋白存在相互作用关系,为此蛋白相互作用网络的中心节点。删除这些节点蛋白后,网络结构涣散。因此,这些蛋白在睡眠剥夺相关疾病的发生和发展中可能起着至关重要的作用。Screening and bioinformatics analysis of differentially expressed genes in sleep
http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-12121-1016004155.htm |
楼主: 小椰树
发表于 2017-5-2 13:13:30
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